ELISA方法測定單克隆抗體實驗原理及操作步驟

ELISA方法測定單克隆抗體實驗原理及操作步驟
一、實驗目的
1. 深入了解ELISA法測定抗體效價的原理。
2. 掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。
二、實驗原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的gao效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子
上，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反應后，作用于底物使之呈色，根據顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術的一
種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌，這既包證了反應的定量關系，也
避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。 酶促反應只進行一次， 而抗原/抗體的免疫反應可進行一次或數次， 即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應。
目常用的幾種ELISA方法有:測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為:先將已知定量抗
原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結合的雜蛋白質，加酶標抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應，用目

測或光電比色測定抗體含量。

三、儀器、原料和試劑
1.儀器
（1.1）聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯免疫閱讀儀、水浴鍋。
2.原料
（2.1）單克隆抗體
3.試劑
（3.1）抗原及酶標記抗體
（3.2）抗原:兔抗人lgG(Rabbit Aanti-human lgG， Code No. A0423);
（3.3）酶標抗抗體:兔抗鼠lgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP， Code No. P0260);使用時按照說明書要求稀釋。
4.洗滌液(含0.05% Tween 20的PBS): 1LPBS 中加入Tween-20 500μ L.
5.封閉液(含1%牛血清白蛋白，0.1% Tween 20的PBS): 10mLPBS 中加入100mgBSA, 10 μ LTween-20.
6.底物溶液
（6.1）磷酸-鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO4 .12H2O2.2g，NaH2PO4 . 2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL.
  (6.2) TMB貯液:稱60mgTMB 溶于10mL二甲基亞砜中，4℃避光保存。
（6.3）底物應用液:現用現配，磷酸鈉緩沖液10ml, TNB 貯液10μ L.30% H2O2 15μL,混勻。
7.終止液: 2mol/LH2S04
四、操作步驟
1、抗原包被:兔抗人lgG作為抗原，用包被液1: 8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。
2、洗滌:次日傾去凹孔內的液體，洗滌液洗3次。
3、封閉:加100μ L/孔封閉液，室溫放置0.5h.
4、洗滌:用洗滌液洗3次。
5、加待測樣品(一抗): 將含單克降抗體的細胞培養上清在另塊板上用PBS連續稀釋(按照1: 2或1: 10)， 100μ L /孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養
基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.
6、洗滌:用洗滌液洗3次。
7、加酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP， 用封閉液1: 8000稀釋，100μL/孔， 加蓋37℃恒溫箱溫育1h.
8、洗滌:用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。
9、顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL孔，室溫暗處放置5~30min，顯示藍色。
10、終止反應、比色。加50μL/孔終止液。顏色變黃:用酶標儀測定450nm
處各孔的吸光值， 陽性反應的蕞大稀釋度為待測樣品的效價。